Table des matières
Introduction
Dans le développement préclinique de médicaments, tout tourne autour de la compréhension des interactions moléculaires. Qu’il s’agisse de complexes protéine-ligand, de liaisons anticorps-antigène ou d’interactions enzyme-inhibiteur, ce qui compte pour la sélection et l’optimisation des substances actives biopharmaceutiques, ce n’est pas seulement de savoir si une molécule se lie, mais aussi avec quelle efficacité, quelle force et pourquoi elle se lie.
C’est là qu’intervient la calorimétrie par titrage isotherme (ITC): une méthode sans étiquette, fonctionnant en solution, qui permet de déterminer l’affinité de liaison, Enthalpie (ΔH), l’entropie (ΔS), l’énergie libre (ΔG) et la stœchiométrie peuvent être déterminées en une seule expérience. Elle permet de caractériser les interactions non seulement qualitativement, mais aussi entièrement thermodynamiquement, et ce dans des conditions quasi physiologiques.
L’ITC est un outil puissant pour le personnel de laboratoire impliqué dans la caractérisation des produits biologiques, des peptides thérapeutiques ou des protéines recombinantes. Dans les premières phases de criblage, elle permet d’identifier rapidement les molécules actives de liaison. Plus tard, elle aide à optimiser les formulations, à valider les systèmes de tampons ou à évaluer les paramètres critiques de stabilité.
Cet article s’adresse à tous ceux qui travaillent en laboratoire sur des substances biopharmaceutiques, que ce soit dans des universités, des start-ups ou des entreprises pharmaceutiques établies. Nous montrons comment fonctionne l’ITC, quand elle est supérieure aux autres méthodes et ce à quoi il faut faire attention pour tirer le meilleur parti de chaque expérience.
Comment fonctionne ITC - et pourquoi cela est crucial
La calorimétrie par titrage isotherme (ITC) est l’une des rares méthodes biophysiques qui mesurent directement la chaleur libérée ou absorbée lors de la liaison de deux molécules. Contrairement aux méthodes spectroscopiques ou basées sur le marquage telles que la SPR (spectroscopie de résonance plasmonique de surface) ou la MST (thermophorèse à l’échelle microscopique), l’ITC fonctionne entièrement sans étiquette et en solution, ce qui la rend particulièrement attrayante pour les échantillons sensibles ou natifs.
Que se passe-t-il dans le cylindre de mesure ?
Le principe est simple mais puissant : la molécule d’analyte (par ex. une protéine) est dissoute dans une cellule calorimétrique très sensible. La molécule de ligand (par exemple un inhibiteur ou un antigène) est titrée à l’aide d’une fine seringue, généralement en 10 à 20 petites injections. Chaque fois que les molécules se lient, de la chaleur est libérée ou absorbée. Cette chaleur est mesurée par l’instrument sous la forme d’une impulsion thermique.
Que fournit concrètement l'ITC ?
Une courbe de liaison est calculée à partir des flux de chaleur à chaque injection. Il en résulte
- Constante de liaison (K): indique la force de la liaison.
- Changement d’enthalpie (ΔH): indique si la liaison est exothermique ou endothermique.
- Changement d’entropie (ΔS): donne des informations sur les changements d’ordre dans le système.
- L’énergie libre (ΔG): L’expression thermodynamique combinée de la liaison.
- Paramètres de stœchiométrie (n): Combien de ligands se lient par molécule cible ?
Ces paramètres aident non seulement à identifier les molécules « hit » ou « lead », mais fournissent également des informations sur le fait que la liaison est entraînée par l’entropie ou l’enthalpie, ce qui est crucial pour l’optimisation ultérieure. En combinant puissance, simplicité et physique directe, l’ITC est l’une des méthodes les plus robustes pour caractériser la liaison moléculaire – en particulier là où la compréhension des bases énergétiques compte.
ITC en action : applications typiques dans le domaine biopharmaceutique
Pour beaucoup de personnes travaillant dans des laboratoires, la question est de savoir quand l’utilisation d’ITC est vraiment rentable.
La réponse : chaque fois qu’il ne s’agit pas seulement de détecter des liaisons, mais de les comprendre en détail. Pour les questions biopharmaceutiques, la calorimétrie par titrage isotherme ne fournit pas seulement des valeurs pour les constantes de liaison, mais aussi des aperçus thermodynamiques profonds qui sont essentiels pour la caractérisation et l’optimisation des médicaments.
Interactions protéine-ligand : Le classique
Dans la recherche précoce sur les substances actives, il s’agit justement d’identifier les partenaires de liaison, de quantifier leur affinité et de décider si une structure directrice a un potentiel. Avec l’ITC , il est possible de :
- tester de petites molécules (par exemple des inhibiteurs) contre des enzymes ou des protéines de transport
- Étudier les agents peptidiques et leur liaison à la cible
- Capter énergétiquement les changements de conformation lors de la liaison
Interactions anticorps-antigènes : Comprendre l'affinité, pas seulement la mesurer
La méthode fournit des résultats pour les solides et les liquides, ainsi que pour les poudres et les pâtes, avec une grande précision de mesure, ce qui la rend particulièrement précieuse pour le développement de matériaux d’électrodes innovants.
Considérations spécifiques aux matériaux et effets du vieillissement
Pour le développement de produits thérapeutiques à base d’anticorps, l’ITC est un complément précieux :
- mesure précise de l’enthalpie et de l’entropie de liaison (→ empreintes thermodynamiques)
- Évaluation de la stœchiométrie (par ex. liaison monovalente vs. bivalente)
- Comparaison des variants d’anticorps natifs et modifiés dans le tampon ou le sérum
Cela permet non seulement de sélectionner les meilleurs candidats de liaison, mais aussi de tirer des conclusions sur les épitopes et les mécanismes de liaison.
Développement de formulations : criblage de tampons et analyses de stabilité
L’ITC peut également être révélatrice sans liaison au ligand – par exemple pour l’analyse :
- de la sélection des tampons (par exemple, si un tampon interagit lui-même avec la protéine)
- de la stabilité thermique via des expériences dites de « chaleur de dilution ».
- de systèmes auto-associés (par exemple, agrégation, dimérisation).
Un exemple pratique : Dans une étude, l’ITC a été utilisée pour tester des protéines recombinantes dans différentes formulations. Cette expérience a révélé non seulement des différences dans l’affinité de liaison, mais aussi des indices d’instabilité structurelle – bien avant que des agrégations visibles n’apparaissent.
Conclusion
L’ITC fournit des données précises, robustes et approfondies que les méthodes classiques n’offrent souvent pas ou seulement de manière indirecte. Pour les utilisateurs de laboratoire, cela signifie un outil qui permet de gagner du temps, de sécuriser les expériences et de prendre des décisions éclairées.
Bibliographie
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