Índice
Introdução
No desenvolvimento pré-clínico de medicamentos, tudo gira em torno da compreensão das interações moleculares. Quer se trate de complexos proteína-ligando, de ligação anticorpo-antigénio ou de interações enzima-inibidor – para a seleção e otimização de princípios activos biofarmacêuticos, não se trata apenas de saber se uma molécula se liga, mas também de saber como, com que intensidade e porque se liga.
É exatamente aqui que entra em jogo a calorimetria de titulação isotérmica (ITC): um método sem etiquetas que funciona em solução para determinar a afinidade de ligação, entalpia (ΔH) entropia (ΔS), a energia livre (ΔG) e a estequiometria podem ser determinadas numa única experiência. Torna possível caraterizar as interações não só qualitativamente, mas também de forma completamente termodinâmica – e em condições quase fisiológicas.
O ITC é uma ferramenta poderosa para o pessoal de laboratório envolvido na caraterização de produtos biológicos, terapêuticas peptídicas ou proteínas recombinantes. Nas fases iniciais de rastreio, permite a identificação rápida de moléculas activas de ligação. Mais tarde, ajuda a otimizar formulações, validar sistemas tampão ou avaliar parâmetros críticos de estabilidade.
Este artigo destina-se a qualquer pessoa que trabalhe com princípios activos biofarmacêuticos no laboratório – seja em universidades, empresas em fase de arranque ou empresas farmacêuticas estabelecidas. Mostramos como funciona o ITC, quando é superior a outros métodos e o que deves ter em atenção para tirares o melhor partido de cada experiência.
Como funciona a ITC - e porque é crucial
A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é um dos poucos métodos biofísicos que mede diretamente o calor libertado ou absorvido quando duas moléculas se ligam. Ao contrário dos métodos espectroscópicos ou baseados em etiquetas, como a SPR (espetroscopia de ressonância plasmónica de superfície) ou a MST (termoforese em microescala), a ITC funciona completamente sem etiquetas e em solução, o que a torna particularmente atractiva para amostras sensíveis ou nativas.
O que acontece na proveta?
O princípio é simples mas poderoso: a molécula do analito (por exemplo, uma proteína) é dissolvida numa célula calorimétrica altamente sensível. A molécula ligante (por exemplo, um inibidor ou antigénio) é titulada através de uma seringa fina – normalmente em 10-20 pequenas injecções. Cada vez que as moléculas se ligam, o calor é libertado ou absorvido. Este calor é medido pelo dispositivo como um impulso térmico.
O que é que a ITC realmente produz?
Uma curva de ligação é calculada a partir dos fluxos de calor para cada injeção. Isto resulta em
- Constante de ligação (K): Indica a força da ligação.
- Alteração de entalpia (ΔH): Mostra se a ligação é exotérmica ou endotérmica.
- Mudança de entropia (ΔS): Fornece informações sobre mudanças de ordem no sistema.
- Energia livre (ΔG): A expressão termodinâmica combinada da ligação.
- Parâmetro de estequiometria (n): Quantos ligandos se ligam por molécula alvo?
Estes parâmetros não só ajudam a identificar moléculas de sucesso ou líderes, como também fornecem informações sobre se a ligação é impulsionada por entropia ou entalpia, o que é crucial para a otimização subsequente. Com a sua combinação de valor informativo, simplicidade e diretriz física, o ITC é um dos métodos mais robustos para caraterizar a ligação molecular – especialmente quando é importante compreender a base energética.
ITC em uso: aplicações típicas em produtos biofarmacêuticos
Para muitos no laboratório, coloca-se a questão: quando é que vale realmente a pena utilizar as TIC ?
A resposta: Sempre que o objetivo não é apenas detetar ligações, mas compreendê-las em pormenor. A calorimetria de titulação isotérmica não só fornece valores para as constantes de ligação para questões biofarmacêuticas, como também oferece conhecimentos termodinâmicos profundos que são cruciais para a caraterização e otimização de ingredientes activos.
Interações proteína-ligando: O clássico
Na investigação inicial de medicamentos, em particular, o objetivo é identificar os parceiros de ligação, quantificar a sua afinidade e decidir se uma estrutura principal tem potencial. O ITC pode ser utilizado para:
- Testa pequenas moléculas (por exemplo, inibidores) contra enzimas ou proteínas de transporte
- Investigação dos princípios activos dos péptidos e da sua ligação ao alvo
- Deteção energética de alterações conformacionais durante a ligação
Interações anticorpo-antigénio: Compreender a afinidade, não apenas medi-la
O método fornece resultados para sólidos e líquidos, bem como para pós e pastas, com elevada precisão de medição, o que o torna particularmente valioso para o desenvolvimento de materiais de eléctrodos inovadores.
Considerações específicas do material e efeitos do envelhecimento
A ITC é um complemento valioso para o desenvolvimento de terapêuticas baseadas em anticorpos:
- Medição precisa da entalpia e entropia das ligações (→ impressões digitais termodinâmicas)
- Avaliação da estequiometria (por exemplo, ligação monovalente vs. bivalente)
- Comparação de variantes de anticorpos nativos e modificados em tampão ou soro
Isto não só permite a seleção dos melhores candidatos de ligação, como também permite tirar conclusões sobre epítopos e mecanismos de ligação.
Desenvolvimento de formulações: análise de tampões e de estabilidade
O ITC também pode ser informativo sem ligação de ligandos – por exemplo, para análise:
- Seleção do tampão (por exemplo, se o próprio tampão interage com a proteína)
- da estabilidade térmica através das chamadas experiências de “calor de diluição
- de sistemas auto-associados (por exemplo, agregação, dimerização).
Um exemplo da prática: Num estudo, o ITC foi utilizado para testar proteínas recombinantes em diferentes formulações. Isto revelou não só diferenças na afinidade de ligação, mas também indicações de instabilidades estruturais – muito antes de ocorrerem agregações visíveis.
Conclusão
O ITC fornece dados precisos, robustos e aprofundados que os métodos convencionais muitas vezes não oferecem, ou oferecem apenas indiretamente. Para os utilizadores do laboratório, isto significa: uma ferramenta que poupa tempo, protege as experiências e permite decisões bem fundamentadas.
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