Indice dei contenuti
Introduzione
Nello sviluppo preclinico dei farmaci, tutto ruota intorno alla comprensione delle interazioni molecolari. Che si tratti di complessi proteina-ligando, di legami anticorpo-antigene o di interazioni enzima-inibitore, per la selezione e l’ottimizzazione dei principi attivi biofarmaceutici non conta solo se una molecola si lega, ma anche quanto bene, quanto fortemente e perché si lega.
È proprio qui che entra in gioco la calorimetria a titolazione isotermica (ITC): un metodo privo di etichette che funziona in soluzione per determinare l’affinità di legame, entalpia (ΔH) entropia (ΔS), energia libera (ΔG) e stechiometria in un unico esperimento. Questo permette di caratterizzare le interazioni non solo in modo qualitativo, ma anche in modo completamente termodinamico e in condizioni quasi fisiologiche.
L ‘ITC è un potente strumento per il personale di laboratorio coinvolto nella caratterizzazione di biologici, terapici peptidici o proteine ricombinanti. Nelle prime fasi di screening, permette di identificare rapidamente le molecole attive. In seguito, aiuta a ottimizzare le formulazioni, a convalidare i sistemi tampone o a valutare i parametri critici di stabilità.
Questo articolo si rivolge a tutti coloro che lavorano in laboratorio su principi attivi biofarmaceutici, sia che si tratti di università, start-up o aziende farmaceutiche affermate. Ti mostriamo come funziona l’ITC, quando è superiore ad altri metodi e a cosa devi prestare attenzione per ottenere il meglio da ogni esperimento.
Come funziona l'ITC e perché è fondamentale
La calorimetria isotermica a titolazione (ITC) è uno dei pochi metodi biofisici che misura direttamente il calore rilasciato o assorbito quando due molecole si legano. A differenza dei metodi spettroscopici o basati sull’etichettatura, come la SPR (spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie) o la MST (termoforesi su microscala), l’ITC funziona completamente senza etichetta e in soluzione, il che la rende particolarmente interessante per campioni sensibili o nativi.
Cosa succede nel cilindro di misurazione?
Il principio è semplice ma potente: la molecola dell’analita (ad esempio una proteina) viene disciolta in una cella calorimetrica altamente sensibile. La molecola del legante (ad esempio un inibitore o un antigene) viene titolata tramite una siringa sottile, solitamente in 10-20 piccole iniezioni. Ogni volta che le molecole si legano, viene rilasciato o assorbito del calore. Questo calore viene misurato dal dispositivo sotto forma di impulso termico.
Quali sono i risultati effettivi dell'ITC?
Una curva di legame viene calcolata a partire dai flussi di calore per ogni iniezione. Il risultato è
- Costante di legame (K): indica quanto è forte il legame.
- Variazione di entalpia (ΔH): indica se il legame è esotermico o endotermico.
- Variazione di entropia (ΔS): fornisce informazioni sui cambiamenti di ordine nel sistema.
- Energia libera (ΔG): L’espressione termodinamica combinata del legame.
- Parametro stechiometrico (n): Quanti ligandi si legano per ogni molecola bersaglio?
Questi parametri non solo aiutano a identificare le molecole di successo o di punta, ma forniscono anche informazioni sul fatto che il legame sia guidato dall’entropia o dall’entalpia, un fattore cruciale per la successiva ottimizzazione. La combinazione di valore informativo, semplicità e immediatezza fisica rende l ‘ITC uno dei metodi più robusti per la caratterizzazione dei legami molecolari, soprattutto quando è importante comprenderne la base energetica.
ITC in uso: applicazioni tipiche nel settore biofarmaceutico
Per molti laboratori si pone la domanda: quando vale davvero la pena utilizzare l’ITC ?
La risposta: ogni volta che l’obiettivo non è solo quello di rilevare i legami, ma di comprenderli nel dettaglio. La calorimetria isotermica a titolazione non solo fornisce i valori delle costanti di legame per le questioni biofarmaceutiche, ma offre anche approfondimenti termodinamici fondamentali per la caratterizzazione e l’ottimizzazione dei principi attivi.
Interazioni proteina-ligando: Il classico
In particolare, nelle prime ricerche sui farmaci, l’obiettivo è identificare i partner di legame, quantificare la loro affinità e decidere se una struttura principale ha un potenziale. L’ITC può essere utilizzato per:
- Testare piccole molecole (ad esempio inibitori) contro enzimi o proteine di trasporto
- Indagine sui principi attivi dei peptidi e sul loro legame con il bersaglio
- Rilevamento energetico dei cambiamenti conformazionali durante il legame
Interazioni anticorpo-antigene: Capire l'affinità, non solo misurarla
Il metodo fornisce risultati per solidi e liquidi, nonché per polveri e paste, con un’elevata precisione di misurazione, il che lo rende particolarmente prezioso per lo sviluppo di materiali elettrodici innovativi.
Considerazioni specifiche sui materiali ed effetti dell'invecchiamento
L ‘ITC è un’aggiunta preziosa allo sviluppo di terapie a base di anticorpi:
- Misurazione precisa dell’entalpia e dell’entropia di legame (→ impronte termodinamiche)
- Valutazione della stechiometria (es. legame monovalente vs. bivalente)
- Confronto tra varianti di anticorpi native e modificate in tampone o siero
Questo non solo permette di selezionare i migliori candidati al legame, ma consente anche di trarre conclusioni sugli epitopi e sui meccanismi di legame.
Sviluppo della formulazione: screening dei tamponi e analisi di stabilità
L ‘ITC può essere utile anche senza legare il ligando, ad esempio per l’analisi:
- Selezione del tampone (ad esempio, se il tampone stesso interagisce con la proteina)
- della stabilità termica attraverso i cosiddetti esperimenti di “calore di diluizione”.
- di sistemi auto-associanti (ad esempio, aggregazione, dimerizzazione).
Un esempio dalla pratica: In uno studio, l’ITC è stata utilizzata per testare le proteine ricombinanti in diverse formulazioni. Ciò ha rivelato non solo differenze nell’affinità di legame, ma anche indicazioni di instabilità strutturali, molto prima che si verificassero aggregazioni visibili.
Conclusione
L ‘ITC fornisce dati precisi, robusti e approfonditi che i metodi convenzionali spesso non offrono, o lo fanno solo indirettamente. Per gli utenti del laboratorio, questo significa: uno strumento che fa risparmiare tempo, assicura gli esperimenti e permette di prendere decisioni fondate.
Bibliografia
[1] V. Linkuviene, G. Krainer, W.-Y. Chen, D. Matulis, Isothermal titration calorimetry for drug design: Precision of the enthalpy and binding constant measurements and comparison of the instruments, Analytical Biochemistry 515, 61-64, 2016
[2] H. Su, Y. Xu, Application of ITC-Based Characterisation of Thermodynamic and Kinetic Association of Ligands With Proteins in Drug Design, Frontiers in Pharmacology 9, 1133, 2018
[3] L. Baranauskiene, T.-C. Kuo, W.-Y. Chen, D. Matulis, Isothermal titration calorimetry for characterisation of recombinant proteins, Current Opinion in Biotechnology 55, 9-15, 2019
[4] N. L. Traulsen, Thermodynamic analysis of supramolecules by isothermal titration calorimetry, dissertation, 2015, Freie Universität Berlin
