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Introducción
En el desarrollo preclínico de fármacos, todo gira en torno a la comprensión de las interacciones moleculares. Ya sean complejos proteína-ligando, unión anticuerpo-antígeno o interacciones enzima-inhibidor, para la selección y optimización de principios activos biofarmacéuticos, no se trata sólo de si una molécula se une, sino de lo bien, lo fuerte y por qué se une.
Aquí es exactamente donde entra en juego la calorimetría de valoración isotérmica (ITC ): un método sin etiquetas que funciona en solución para determinar la afinidad de unión, la entalpía (ΔH)la entropía (ΔS), la energía libre (ΔG) y la estequiometría pueden determinarse en un solo experimento. Permite caracterizar las interacciones no sólo cualitativamente, sino también de forma completamente termodinámica, y en condiciones casi fisiológicas.
El ITC es una potente herramienta para el personal de laboratorio que participa en la caracterización de productos biológicos, terapias peptídicas o proteínas recombinantes. En las primeras fases de cribado, permite identificar rápidamente las moléculas con actividad de unión. Más adelante, ayuda a optimizar formulaciones, validar sistemas tampón o evaluar parámetros críticos de estabilidad.
Este artículo va dirigido a cualquier persona que trabaje con principios activos biofarmacéuticos en el laboratorio, ya sea en universidades, empresas de nueva creación o compañías farmacéuticas establecidas. Te mostramos cómo funciona el ITC, cuándo es superior a otros métodos y qué debes tener en cuenta para obtener lo mejor de cada experimento.
Cómo funciona el ITC - y por qué es crucial
La calorimetría de valoración isotérmica (ITC ) es uno de los pocos métodos biofísicos que miden directamente el calor liberado o absorbido cuando se unen dos moléculas. A diferencia de los métodos espectroscópicos o basados en el etiquetado, como la SPR (espectroscopia de resonancia de plasmones superficiales) o la MST (termoforesis a microescala), la ITC funciona completamente sin etiquetado y en solución, lo que la hace especialmente atractiva para muestras sensibles o nativas.
¿Qué ocurre en la probeta?
El principio es sencillo pero potente: la molécula de analito (por ejemplo, una proteína) se disuelve en una célula calorimétrica de alta sensibilidad. La molécula ligando (por ejemplo, un inhibidor o un antígeno) se titula mediante una jeringa fina, normalmente en 10-20 pequeñas inyecciones. Cada vez que las moléculas se unen, se libera o absorbe calor. El aparato mide este calor como un impulso térmico.
¿Qué aporta realmente la ITC?
Se calcula una curva de enlace a partir de los flujos de calor de cada inyección. El resultado es
- Constante de enlace (K): Indica lo fuerte que es el enlace.
- Cambio de entalpía (ΔH): Muestra si el enlace es exotérmico o endotérmico.
- Cambio de entropía (ΔS): Proporciona información sobre los cambios de orden en el sistema.
- Energía libre (ΔG): La expresión termodinámica combinada del enlace.
- Parámetro de estequiometría (n): ¿Cuántos ligandos se unen por molécula diana?
Estos parámetros no sólo ayudan a identificar las moléculas «hit» o «lead», sino que también proporcionan información sobre si el enlace se rige por la entropía o la entalpía, lo que es crucial para la optimización posterior. Por su combinación de valor informativo, sencillez y dirección física, el ITC es uno de los métodos más sólidos para caracterizar los enlaces moleculares, especialmente cuando es importante comprender la base energética.
El ITC en uso: aplicaciones típicas en biofarmacia
Para muchos en el laboratorio surge la pregunta: ¿Cuándo merece realmente la pena utilizar las TIC ?
La respuesta: Siempre que el objetivo no sea sólo detectar enlaces, sino comprenderlos en detalle. La calorimetría de valoración isotérmica no sólo proporciona valores de las constantes de enlace para cuestiones biofarmacéuticas, sino que también ofrece profundos conocimientos termodinámicos que son cruciales para la caracterización y optimización de los principios activos.
Interacciones proteína-ligando: El clásico
En particular, en la investigación inicial de fármacos, el objetivo es identificar a los socios de unión, cuantificar su afinidad y decidir si una estructura principal tiene potencial. El ITC puede utilizarse para:
- Probar moléculas pequeñas (por ejemplo, inhibidores) contra enzimas o proteínas de transporte
- Investigación de los principios activos peptídicos y su unión a la diana
- Detección energética de cambios conformacionales durante la unión
Interacciones anticuerpo-antígeno: Comprender la afinidad, no sólo medirla
El método proporciona resultados para sólidos y líquidos, así como para polvos y pastas, con una gran precisión de medición, lo que lo hace especialmente valioso para el desarrollo de materiales de electrodos innovadores.
Consideraciones específicas del material y efectos del envejecimiento
El ITC es un valioso complemento para el desarrollo de terapias basadas en anticuerpos:
- Medición precisa de la entalpía y entropía de enlace (→ huellas termodinámicas)
- Evaluación de la estequiometría (por ejemplo, unión monovalente frente a bivalente)
- Comparación de variantes de anticuerpos nativos y modificados en tampón o suero
Esto no sólo permite seleccionar los mejores candidatos de unión, sino también sacar conclusiones sobre los epítopos y los mecanismos de unión.
Desarrollo de la formulación: cribado de tampones y análisis de estabilidad
La ITC también puede ser informativa sin la unión del ligando, por ejemplo para el análisis:
- Selección del tampón (por ejemplo, si un tampón interactúa con la proteína)
- de la estabilidad térmica mediante los llamados experimentos de «calor de dilución».
- de sistemas autoasociados (por ejemplo, agregación, dimerización).
Un ejemplo de la práctica: En un estudio, se utilizó el ITC para probar proteínas recombinantes en diferentes formulaciones. Esto reveló no sólo diferencias en la afinidad de unión, sino también indicios de inestabilidades estructurales, mucho antes de que se produjeran agregaciones visibles.
Conclusión
El ITC proporciona datos precisos, sólidos y profundos que los métodos convencionales a menudo no ofrecen, o sólo indirectamente. Para los usuarios de laboratorio, esto significa: una herramienta que ahorra tiempo, asegura los experimentos y permite tomar decisiones bien fundadas.
Bibliografía
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