İçindekiler
Giriş
Preklinik ilaç geliştirmede her şey moleküler etkileşimlerin anlaşılması etrafında dönmektedir. İster protein-ligand kompleksleri, ister antikor-antijen bağlanması veya enzim-inhibitör etkileşimleri olsun – biyofarmasötik etken maddelerin seçimi ve optimizasyonu için önemli olan sadece bir molekülün bağlanıp bağlanmadığı değil, ne kadar iyi, ne kadar güçlü ve neden bağlandığıdır.
İşte tam da bu noktada izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) devreye giriyor: bağlanma afinitesini belirlemek için çözelti içinde çalışan etiketsiz bir yöntem, entalpi (ΔH)entropi (ΔS), serbest enerji (ΔG) ve stokiyometri tek bir deneyde belirlenebilir. Bu da etkileşimleri sadece niteliksel olarak değil, aynı zamanda tamamen termodinamik olarak ve neredeyse fizyolojik koşullar altında karakterize etmeyi mümkün kılar.
ITC , biyolojik ilaçların, peptit terapötiklerinin veya rekombinant proteinlerin karakterizasyonunda görev alan laboratuvar personeli için güçlü bir araçtır. Erken tarama aşamalarında, bağlayıcı-aktif moleküllerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Daha sonra, formülasyonları optimize etmeye, tampon sistemlerini doğrulamaya veya kritik stabilite parametrelerini değerlendirmeye yardımcı olur.
Bu makale, ister üniversitelerde, ister yeni kurulan şirketlerde veya köklü ilaç şirketlerinde olsun, laboratuvarda biyofarmasötik etken maddeler üzerinde çalışan herkese yöneliktir. ITC’nin nasıl çalıştığını, ne zaman diğer yöntemlerden daha üstün olduğunu ve her deneyden en iyi sonucu almak için nelere dikkat etmeniz gerektiğini gösteriyoruz.
ITC nasıl çalışır - ve neden çok önemlidir
İzotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), iki molekül bağlandığında açığa çıkan veya emilen ısıyı doğrudan ölçen birkaç biyofiziksel yöntemden biridir. SPR (yüzey plazmon rezonans spektroskopisi) veya MST (mikro ölçekli termoforez) gibi spektroskopik veya etiketlemeye dayalı yöntemlerin aksine, ITC tamamen etiketsiz ve çözelti içinde çalışır, bu da onu hassas veya doğal numuneler için özellikle çekici kılar.
Ölçüm silindirinde ne olur?
Prensip basit ama güçlüdür: analit molekülü (örneğin bir protein) son derece hassas bir kalorimetre hücresinde çözülür. Ligand molekülü (örneğin bir inhibitör veya antijen) ince bir şırınga aracılığıyla titre edilir – genellikle 10-20 küçük enjeksiyonda. Moleküller her bağlandığında ısı açığa çıkar veya emilir. Bu ısı cihaz tarafından termal puls olarak ölçülür.
ITC gerçekte ne sağlıyor?
Her enjeksiyon için ısı akışlarından bir bağlanma eğrisi hesaplanır. Bu şu sonuçları verir
- Bağlanma sabiti (K): Bağın ne kadar güçlü olduğunu gösterir.
- Entalpi değişimi (ΔH): Bağın ekzotermik mi yoksa endotermik mi olduğunu gösterir.
- Entropi değişimi (ΔS): Sistemdeki düzen değişimleri hakkında bilgi verir.
- Serbest enerji (ΔG): Bağın birleşik termodinamik ifadesi.
- Stokiyometri parametresi (n): Hedef molekül başına kaç ligand bağlanır?
Bu parametreler sadece isabetli veya öncü moleküllerin belirlenmesine yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bağın entropi veya entalpi odaklı olup olmadığı hakkında bilgi sağlar, bu da sonraki optimizasyon için çok önemlidir. Bilgilendirici değer, basitlik ve fiziksel doğrudanlığın birleşimi, ITC ‘yi moleküler bağı karakterize etmek için en sağlam yöntemlerden biri haline getirir – özellikle de enerjik temeli anlamanın önemli olduğu durumlarda.
Kullanımda ITC: biyofarmasötiklerde tipik uygulamalar
Laboratuvardaki birçok kişi için şu soru ortaya çıkıyor: ITC ‘nin kullanımı ne zaman gerçekten faydalı olur?
Cevap: Amaç sadece bağları tespit etmek değil, onları ayrıntılı olarak anlamak olduğunda. İzotermal titrasyon kalorimetrisi sadece biyofarmasötik konular için bağlanma sabitleri için değerler sağlamakla kalmaz, aynı zamanda aktif bileşenlerin karakterizasyonu ve optimizasyonu için çok önemli olan derin termodinamik bilgiler sunar.
Protein-ligand etkileşimleri: Klasik
Özellikle erken ilaç araştırmalarında amaç, bağlanma ortaklarını tanımlamak, afinitelerini ölçmek ve bir öncü yapının potansiyeli olup olmadığına karar vermektir. ITC aşağıdakiler için kullanılabilir:
- Küçük molekülleri (örn. inhibitörler) enzimlere veya taşıma proteinlerine karşı test edin
- Peptit aktif bileşenlerinin ve hedefe bağlanmalarının araştırılması
- Bağlanma sırasında konformasyonel değişikliklerin enerjetik tespiti
Antikor-antijen etkileşimleri: Yakınlığı sadece ölçmek değil, anlamak
Yöntem, katılar ve sıvıların yanı sıra tozlar ve macunlar için de yüksek ölçüm doğruluğuna sahip sonuçlar verir ve bu da onu yenilikçi elektrot malzemelerinin geliştirilmesi için özellikle değerli kılar.
Malzemeye özgü hususlar ve yaşlanma etkileri
ITC , antikor bazlı terapötiklerin geliştirilmesine değerli bir katkı sağlamaktadır:
- Bağ entalpisi ve entropisinin hassas ölçümü (→ termodinamik parmak izleri)
- Stokiyometrinin değerlendirilmesi (örn. monovalent vs. bivalent bağlanma)
- Doğal ve modifiye antikor varyantlarının tampon veya serum içinde karşılaştırılması
Bu sadece en iyi bağlanma adaylarının seçilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda epitoplar ve bağlanma mekanizmaları hakkında sonuçlar çıkarılmasına da olanak tanır.
Formülasyon geliştirme: tampon tarama ve stabilite analizleri
ITC , ligand bağlanmadan da bilgilendirici olabilir – örneğin analiz için:
- Tampon seçimi (örneğin bir tamponun kendisinin protein ile etkileşime girip girmediği)
- “seyreltme ısısı” olarak adlandırılan deneyler yoluyla termal kararlılık
- kendi kendine birleşen sistemler (örn. agregasyon, dimerizasyon).
Uygulamadan bir örnek: Bir çalışmada, ITC farklı formülasyonlardaki rekombinant proteinleri test etmek için kullanılmıştır. Bu, sadece bağlanma afinitesindeki farklılıkları değil, aynı zamanda görünür agregasyonlar meydana gelmeden çok önce yapısal kararsızlıkların göstergelerini de ortaya çıkardı.
Sonuç
ITC , geleneksel yöntemlerin genellikle sunmadığı veya sadece dolaylı olarak sunduğu hassas, sağlam ve derinlemesine veriler sağlar. Laboratuvar kullanıcıları için bunun anlamı şudur: zaman kazandıran, deneyleri güvence altına alan ve sağlam temellere dayanan kararlar alınmasını sağlayan bir araç.
Bibliyografya
[1] V. Linkuviene, G. Krainer, W.-Y. Chen, D. Matulis, Isothermal titration calorimetry for drug design: Precision of the enthalpy and binding constant measurements and comparison of the instruments, Analytical Biochemistry 515, 61-64, 2016
[2] H. Su, Y. Xu, İlaç Tasarımında Ligandların Proteinlerle Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin ITC Tabanlı Karakterizasyonunun Uygulanması, Frontiers in Pharmacology 9, 1133, 2018
[3] L. Baranauskiene, T.-C. Kuo, W.-Y. Chen, D. Matulis, Rekombinant proteinlerin karakterizasyonu için izotermal titrasyon kalorimetrisi, Current Opinion in Biotechnology 55, 9-15, 2019
[4] N. L. Traulsen, İzotermal titrasyon kalorimetrisi ile supramoleküllerin termodinamik analizi, doktora tezi, 2015, Freie Universität Berlin
