Spis treści
Wprowadzenie
W przedklinicznym opracowywaniu leków wszystko kręci się wokół zrozumienia interakcji molekularnych. Niezależnie od tego, czy chodzi o kompleksy białko-ligand, wiązanie przeciwciał z antygenem czy interakcje enzym-inhibitor – przy wyborze i optymalizacji biofarmaceutycznych składników aktywnych nie chodzi tylko o to, czy cząsteczka się wiąże, ale jak dobrze, jak silnie i dlaczego się wiąże.
Właśnie w tym miejscu do gry wkracza izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC): metoda wolna od etykiet, która działa w roztworze w celu określenia powinowactwa wiązania, entalpię (ΔH) entropię (ΔS), energię swobodną (ΔG) i stechiometrię można określić w jednym eksperymencie. Umożliwia to scharakteryzowanie interakcji nie tylko jakościowo, ale także całkowicie termodynamicznie – i to w warunkach niemal fizjologicznych.
ITC jest potężnym narzędziem dla personelu laboratoryjnego zaangażowanego w charakteryzację leków biologicznych, terapeutyków peptydowych lub białek rekombinowanych. We wczesnych fazach badań przesiewowych pozwala na szybką identyfikację cząsteczek wiążących. Później pomaga w optymalizacji formulacji, walidacji systemów buforowych lub ocenie krytycznych parametrów stabilności.
Niniejszy artykuł skierowany jest do wszystkich osób pracujących nad biofarmaceutycznymi składnikami aktywnymi w laboratorium – zarówno na uniwersytetach, w start-upach, jak i w firmach farmaceutycznych o ugruntowanej pozycji. Pokazujemy, jak działa ITC, kiedy jest lepsza od innych metod i na co należy zwrócić uwagę, aby jak najlepiej wykorzystać każdy eksperyment.
Jak działa ITC - i dlaczego ma kluczowe znaczenie
Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest jedną z niewielu metod biofizycznych, która bezpośrednio mierzy ciepło uwalniane lub pochłaniane podczas wiązania dwóch cząsteczek. W przeciwieństwie do metod spektroskopowych lub opartych na znakowaniu, takich jak SPR (spektroskopia rezonansu plazmonów powierzchniowych) lub MST (termoforeza w mikroskali), ITC działa całkowicie bez znakowania i w roztworze, co czyni ją szczególnie atrakcyjną dla wrażliwych lub natywnych próbek.
Co dzieje się w cylindrze pomiarowym?
Zasada jest prosta, ale skuteczna: cząsteczka analitu (np. białka) jest rozpuszczana w bardzo czułej komorze kalorymetrycznej. Cząsteczka ligandu (np. inhibitor lub antygen) jest miareczkowana za pomocą cienkiej strzykawki – zwykle w 10-20 małych zastrzykach. Za każdym razem, gdy cząsteczki wiążą się, ciepło jest uwalniane lub pochłaniane. Ciepło to jest mierzone przez urządzenie jako impuls termiczny.
Co tak naprawdę zapewnia ITC?
Krzywa wiązania jest obliczana na podstawie przepływów ciepła dla każdego wtrysku. Daje to następujące wyniki
- Stała wiązania (K): Wskazuje, jak silne jest wiązanie.
- Zmiana entalpii (ΔH): Pokazuje, czy wiązanie jest egzotermiczne czy endotermiczne.
- Zmiana entropii (ΔS): Dostarcza informacji o zmianach kolejności w systemie.
- Energia swobodna (ΔG): Połączone wyrażenie termodynamiczne wiązania.
- Parametr stechiometrii (n): Ile ligandów wiąże się z cząsteczką docelową?
Parametry te nie tylko pomagają zidentyfikować trafione lub wiodące cząsteczki, ale także dostarczają informacji o tym, czy wiązanie jest oparte na entropii czy entalpii, co ma kluczowe znaczenie dla późniejszej optymalizacji. Dzięki połączeniu wartości informacyjnej, prostoty i fizycznej bezpośredniości, ITC jest jedną z najbardziej niezawodnych metod charakteryzowania wiązań molekularnych – szczególnie tam, gdzie ważne jest zrozumienie podstaw energetycznych.
ITC w użyciu: typowe zastosowania w biofarmaceutyce
Dla wielu osób w laboratorium pojawia się pytanie: kiedy naprawdę warto korzystać z ITC ?
Odpowiedź: Ilekroć celem jest nie tylko wykrycie wiązań, ale ich szczegółowe zrozumienie. Izotermiczna kalorymetria miareczkowa nie tylko dostarcza wartości stałych wiązania dla zagadnień biofarmaceutycznych, ale także oferuje głęboki wgląd termodynamiczny, który ma kluczowe znaczenie dla charakterystyki i optymalizacji składników aktywnych.
Interakcje białko - ligand: Klasyczne
W szczególności we wczesnych badaniach nad lekami celem jest identyfikacja partnerów wiążących, ilościowe określenie ich powinowactwa i podjęcie decyzji, czy struktura wiodąca ma potencjał. ITC można wykorzystać do:
- Testowanie małych cząsteczek (np. inhibitorów) przeciwko enzymom lub białkom transportowym.
- Badanie aktywnych składników peptydowych i ich docelowego wiązania
- Energetyczne wykrywanie zmian konformacyjnych podczas wiązania
Interakcje przeciwciało-antygen: Zrozumienie powinowactwa, a nie tylko jego pomiar
Metoda zapewnia wyniki dla ciał stałych i cieczy, a także proszków i past z wysoką dokładnością pomiaru, co czyni ją szczególnie cenną dla rozwoju innowacyjnych materiałów elektrodowych.
Względy specyficzne dla materiału i efekty starzenia
ITC jest cennym dodatkiem do rozwoju terapii opartych na przeciwciałach:
- Precyzyjny pomiar entalpii i entropii wiązań (→ termodynamiczne odciski palców)
- Ocena stechiometrii (np. wiązanie jedno- lub dwuwartościowe)
- Porównanie natywnych i zmodyfikowanych wariantów przeciwciał w buforze lub surowicy
Umożliwia to nie tylko wybór najlepszych kandydatów do wiązania, ale także pozwala na wyciągnięcie wniosków na temat epitopów i mechanizmów wiązania.
Rozwój formulacji: badania przesiewowe buforów i analizy stabilności
ITC może również dostarczać informacji bez wiązania ligandu – na przykład do analizy:
- Wybór buforu (np. czy sam bufor oddziałuje z białkiem)
- stabilności termicznej za pomocą tak zwanych eksperymentów „ciepła rozcieńczenia”
- układów samoasocjujących (np. agregacja, dimeryzacja).
Przykład z praktyki: W jednym z badań wykorzystano ITC do testowania rekombinowanych białek w różnych formulacjach. Ujawniło to nie tylko różnice w powinowactwie wiązania, ale także oznaki niestabilności strukturalnej – na długo przed wystąpieniem widocznych agregacji.
Wnioski
ITC zapewnia precyzyjne, solidne i dogłębne dane, których konwencjonalne metody często nie oferują lub oferują jedynie pośrednio. Dla użytkowników laboratoryjnych oznacza to: narzędzie, które oszczędza czas, zabezpiecza eksperymenty i umożliwia podejmowanie uzasadnionych decyzji.
Bibliografia
[1] V. Linkuviene, G. Krainer, W.-Y. Chen, D. Matulis, Isothermal titration calorimetry for drug design: Precision of the enthalpy and binding constant measurements and comparison of the instruments, Analytical Biochemistry 515, 61-64, 2016.
[2] H. Su, Y. Xu, Application of ITC-Based Characterisation of Thermodynamic and Kinetic Association of Ligands With Proteins in Drug Design, Frontiers in Pharmacology 9, 1133, 2018.
[3] L. Baranauskiene, T.-C. Kuo, W.-Y. Chen, D. Matulis, Isothermal titration calorimetry for characterisation of recombinant proteins, Current Opinion in Biotechnology 55, 9-15, 2019.
[4] N. L. Traulsen, Thermodynamic analysis of supramolecules by isothermal titration calorimetry, rozprawa doktorska, 2015, Freie Universität Berlin.
