목차
소개
전임상 신약 개발에서는 모든 것이 분자 상호작용을 이해하는 것을 중심으로 이루어집니다. 단백질-리간드 복합체, 항체-항원 결합, 효소-억제제 상호작용 등 바이오의약품 활성 성분의 선택과 최적화를 위해서는 분자의 결합 여부뿐 아니라 얼마나 잘, 얼마나 강하게, 왜 결합하는지가 중요합니다.
바로 이 점이 바로 등온 적정 열량 측정(ITC)의 역할입니다. 용액에서 작동하여 결합 친화도를 측정하는 라벨이 필요 없는 방법입니다, 엔탈피(ΔH)엔트로피(ΔS), 자유 에너지(ΔG) 및 화학량론을 한 번의 실험으로 측정할 수 있습니다. 이를 통해 거의 생리적 조건에서 상호작용을 정성적으로뿐만 아니라 완전히 열역학적으로도 특성화할 수 있습니다.
ITC는 생물학적 제제, 펩타이드 치료제 또는 재조합 단백질의 특성 분석에 관여하는 실험실 직원을 위한 강력한 도구입니다. 초기 스크리닝 단계에서는 결합 활성 분자를 신속하게 식별할 수 있습니다. 이후에는 제형 최적화, 버퍼 시스템 검증 또는 중요한 안정성 파라미터를 평가하는 데 도움이 됩니다.
이 글은 대학, 스타트업, 기존 제약회사 등 실험실에서 바이오의약품 활성 성분을 연구하는 모든 사람을 대상으로 합니다. ITC의 작동 방식, 다른 방법보다 우수한 점, 모든 실험에서 최상의 결과를 얻기 위해 주의해야 할 사항을 설명합니다.
ITC의 작동 방식과 중요한 이유
등온 적정 열량 측정법(ITC) 은 두 분자가 결합할 때 방출되거나 흡수되는 열을 직접 측정하는 몇 안 되는 생물물리학적 방법 중 하나입니다. SPR(표면 플라즈몬 공명 분광법) 또는 MST(미세 열영동법)와 같은 분광법 또는 라벨링 기반 방법과 달리 ITC는 완전히 라벨 없이 용액에서 작동하므로 민감하거나 고유한 샘플에 특히 유용합니다.
측정 실린더에서는 어떤 일이 일어나나요?
원리는 간단하지만 강력합니다. 분석 물질 분자(예: 단백질)를 고감도 열량계 셀에 용해시킵니다. 리간드 분자(예: 억제제 또는 항원)는 미세 주사기를 통해 보통 10~20회의 작은 주사를 통해 적정됩니다. 분자가 결합할 때마다 열이 방출되거나 흡수됩니다. 이 열은 장치에서 열 펄스로 측정됩니다.
ITC는 실제로 무엇을 제공하나요?
바인딩 곡선은 각 주입에 대한 열 흐름에서 계산됩니다. 그 결과는 다음과 같습니다.
- 결합 상수(K): 결합의 강도를 나타냅니다.
- 엔탈피 변화(ΔH): 결합이 발열성 결합인지 흡열성 결합인지 표시합니다.
- 엔트로피 변화(ΔS): 시스템에서 주문 변경에 대한 정보를 제공합니다.
- 자유 에너지(ΔG): 결합의 결합 열역학적 표현입니다.
- 화학량론 파라미터(n): 표적 분자당 몇 개의 리간드가 결합하는가?
이러한 매개변수는 히트 또는 리드 분자를 식별하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 결합이 엔트로피 또는 엔탈피 구동인지에 대한 정보를 제공하며, 이는 후속 최적화에 매우 중요합니다. 정보적 가치, 단순성, 물리적 직접성이 결합된 ITC는 분자 결합을 특성화하는 가장 강력한 방법 중 하나이며, 특히 에너지 기반을 이해하는 것이 중요한 경우 더욱 그렇습니다.
사용 중인 ITC: 바이오의약품의 일반적인 애플리케이션
실험실의 많은 사람들에게 ITC를 언제 사용하는 것이 정말 가치 있는 일인지에 대한 의문이 생깁니다.
정답: 결합을 감지하는 것뿐만 아니라 결합을 자세히 이해하는 것이 목표라면 언제든 가능합니다. 등온 적정 열량 측정은 바이오 의약품 문제에 대한 결합 상수에 대한 값을 제공할 뿐만 아니라 활성 성분의 특성화 및 최적화에 중요한 심층적인 열역학적 통찰력을 제공합니다.
단백질-리간드 상호작용: 클래식
특히 초기 약물 연구에서는 결합 파트너를 식별하고, 친화력을 정량화하며, 리드 구조에 잠재력이 있는지 여부를 결정하는 것이 목표입니다. ITC를 사용할 수 있습니다:
- 효소 또는 수송 단백질에 대한 저분자(예: 억제제) 테스트
- 펩타이드 활성 성분과 그 표적 결합에 대한 연구
- 결합 중 형태 변화의 에너지 감지
항체-항원 상호작용: 선호도 측정이 아닌 이해: 선호도 이해
이 방법은 고체와 액체는 물론 분말과 페이스트에 대해서도 높은 측정 정확도로 결과를 제공하므로 혁신적인 전극 재료 개발에 특히 유용합니다.
재료별 고려 사항 및 노화 효과
ITC는 항체 기반 치료제를 개발하는 데 있어 매우 중요한 역할을 합니다:
- 결합 엔탈피 및 엔트로피의 정확한 측정(→ 열역학적 지문)
- 화학량론 평가(예: 1가 결합 대 2가 결합)
- 버퍼 또는 혈청에서 네이티브 및 변형 항체 변이체 비교
이를 통해 최상의 결합 후보를 선택할 수 있을 뿐만 아니라 에피토프와 결합 메커니즘에 대한 결론을 도출할 수 있습니다.
제형 개발: 버퍼 스크리닝 및 안정성 분석
ITC는 리간드 결합 없이도 정보를 제공할 수 있습니다(예: 분석용):
- 버퍼 선택(예: 버퍼 자체가 단백질과 상호작용하는지 여부)
- 소위 “희석열” 실험을 통해 열 안정성을 확인했습니다.
- (예: 집합, 이량체화)의 자기 연관 시스템.
실제 사례입니다: 한 연구에서는 ITC를 사용하여 다양한 제형의 재조합 단백질을 테스트했습니다. 이를 통해 결합 친화력의 차이뿐만 아니라 눈에 보이는 응집체가 발생하기 훨씬 전에 구조적 불안정성의 징후를 발견할 수 있었습니다.
결론
ITC는 기존 방법으로는 제공하지 않거나 간접적으로만 제공하는 정확하고 견고하며 심층적인 데이터를 제공합니다. 실험실 사용자에게는 시간을 절약하고 실험을 안전하게 보호하며 근거에 입각한 의사 결정을 내릴 수 있는 도구라는 의미입니다.
참고 문헌
[1] V. Linkuviene, G. Krainer, W.-Y. Chen, D. Matulis, 약물 설계를 위한 등온 적정 열량 측정: 엔탈피 및 결합 상수 측정의 정밀도 및 기기 비교, 분석 생화학 515, 61-64, 2016
[2] H. Su, Y. Xu, 약물 설계에서 단백질과 리간드의 열역학적 및 운동학적 연관성에 대한 ITC 기반 특성화의 적용, Frontiers in Pharmacology 9, 1133, 2018
[3] L. 바라나우스키엔, T.-C. 쿠오, W.-Y. 첸, D. 마툴리스, 재조합 단백질의 특성화를 위한 등온 적정 열량 측정, 생명공학의 현재 의견 55, 9-15, 2019
[4] N. L. 트라울센, 등온 적정 열량 측정에 의한 초분자의 열역학적 분석, 논문, 2015, 베를린 자유 대학교, 2015
